اثر هورمونهاي مختلف بر القاي كالوس باززايی و تكثير بنه زعفران (.L (Crocus sativus

Saffron Agronomy & Technology Vol. 4, No. 2, Summer 2016, P. 143-154 DOI: 10.22048/jsat.2016.17364 نشریه زراعت و فناوری زعفران جلد 4 شماره 2 تابستان 5931 ص. 549-514 اثر هورمونهاي مختلف بر القاي كالوس باززايی و تكثير بنه زعفران (.L (Crocus sativus 2 3 2 *1 عباس صفرنژاد سيده بي بي ليال علمداری هادی درودی و مرضيه دلير تاريخ دريافت: 00 ارديبهشت 0550 تاريخ پذيرش: 0 آبان 0550 چکیده زعفران گياهي تریپلوئيد است كه منبع متابوليتهای ثانویه و یكي از مهمترین محصوالت اقتصادی و دارویي ایاران مايباشاد. در ایان مطالعه تكثير درون شيشهای زعفران با استفاده از دو رو مستقيم و غيرمستقيم مورد بررسي قرارگرفت. قطعات بنه كه بهعنوان ریزنموناه مورد استفاده قرار گرفتند پس از ضدعفوني به محيط كشت MS با غلظتهای مختلف هورموني مربوط به باززایي مساتقيم و غيارمساتقيم منتقل شدند. تيمار كلرید جيوه % /1 5 بهمدت 1 دقيقه بهترین تيمار برای ضادعفوني زعفاران باود. نتاایج حاصال از تجزیاه واریاانس دادههای باززایي مستقيم نشانداد كه بيشترین بنه در محيط mg/l BAP تشكيل ميشود. مقایسه مياان ينهاای درصاد القاای كاالوس بيان ر تفاوت معنيدار بين تيمارهای مورد استفاده در سطح %5 بود. كالوسزایي یک هفته بعد از كشت آغااز شاد و بهتارین محايط بارای mg/ l BAP القای كالوس محيط + mg/ l 2,4-D شناخته شد. بيشترین تعداد رویان در محايط MS باا غلظات كام NAA mg/ l ( 1/ 5 /1( 5 توليد شد. نتایج حاصل از بررسي جوانهزني رویانها نشانداد كه دربين محيطهای مورد اساتفاده محايط MS باا mg/l NAA بهترین تيمار برای جوانهزني بود. تشكيل بنه تنها در محيط + mg/ l D-2,4 منتقل و سپس بهگلدان و خاک انتقال یافتند. mg/ l BAP مشاهدهشد. بنهها برای سازگاری به جي في کلمات کلیدی: تنظيمكنندههای رشد درون شيشهای رویان. مقدمه زعفااران sativus( )Crocus گياااهي از خااانواده Iridaceae ميباشاد كاه حادود 11 جانس و 511 گوناه دارد. مطالعاات تاریخي نشانميدهد اهلي كاردن زعفاران باه 511 تاا 111 سال قبل از ميالد برميگاردد )2004 Caiola,.)Grilli منشااء زعفااران از شاارق مدیترانااه در آساايا و ایااران ماايباشااد 2000( Strauinger,.)Winterhalter & كشت زعفاران در ایران هند یونان مراكش اسپانيا و... انجاام مايشاود. از كال زعفران دنيا %35/6 در ایران توليد مايشاود و در ایاران اساتان خراسااان باااالترین درصااد توليااد زعفااران را دارا ماايباشااد.)Mollafillai & Shoorideh, 2009; Fernandes, 2004( زعفران گيااهي نيماهگرمسايری اسات و در نقااطي كاه دارای زمستانهای مالیم و تابستانهای گرم و خشک باشد باهخاوبي ميروید. این گياه در دمای بين 95 تا 41 درجه سانتيگاراد و در - دانشيار عضو هيات علمي مركز تحقيقات كشاورزی و منابع طبيعاي خراساان رضاوی یاا شعبه مشهد پژوهشكده بيوتكنولوژی كشاورزی ایران ساازمان تحقيقاات آماوز و تارویج كشاورزی مشهد ایران. - كا رشنا س ارش د بيو ت كنو لو ژی ك ش ااورزی ب خ ا ش ت حقيق اا ت ك ش ا ت با ف ا ت ش اعبه م ش ا ه د پژوهشكده بيوتكنولوژی كشاورزی ایاران ساازمان تحقيقاات آماوز و تارویج كشااورزی مشهد ایران. 9- دكترای جن لداری بخش تحقيقات كشت بافت شعبه مشاهد پژوهشاكده بيوتكنولاوژی كشاورزی ایران سازمان تحقيقات آموز و ترویج كشاورزی مشهد ایران. )*-نویسنده مسئول: )sere14@yahoo.com

888 نشریه زراعت و فناوری زعفران جلد 4 شماره 2 تابستان 5931 ارتفا بين 911 تا 911 متر از سطح دریا از عملكارد مناسابي برخوردار است ( 2009 al., )Behnia, 2008; Sepaskhah et از نظر گياهشناسي زعفران گياهي چند ساله و بدون سااقه اسات كه دارای بنه ( پياز غده پداژه یا كورم( غادهای تقریباا كاروی شكل به قطر 9-5 سانتيمتر ميباشد. از هار بناه 6 تاا 3 بارگ سوزني چمني مانند و تا 9 گل بانفش رنا خاارج مايشاود )2004.)Salopek-sondi, ارز كيفي زعفران بهعلات وجاود متابوليتهای ثانویه اصالي و مشاتقات آن مايباشاد. تركيباات زردرن كروسين مسئول رن زعفران مواد تلخ پيكروكروساين م س ائ و ل طع ام و س ا اف ر ا ن ا ل م س ائ و ل عط ا ر و ب ا وی آ ن مايباشاد )2009 al.,.)omidi et زعفران از زمانهاای قادیم باهعناوان یک چاشني و رن در غذاها همچنين در درمان طيف وسيعي از اختالالت همچون آكنه جو بيماریهای پوساتي خاونریزی مغزی آسم سارفه نفاخ شاكم اخاتالالت معاده بايخاوابي خونریزی مزمن رحم ت سرخ )مخملک( و حتي سرطان ماورد اسااتفاده بااودهاساات ( & Bathaei Adullaev, 2002;.)Mousavi, 2010 زعفران تریپلویيد عقيم بوده و تكثير آن از طریق ایجاد بنههاای تااوپر از گياااه مااادر صااورت ماايگياارد ( & Ghalavand.)Mazaheri, 2000 از این رو بهبود آن از طریق دورگاهگياری ممكن نيست. در این رابطاه رو هاای كشات بافات پتانسايل خوبي را برای بهبود ژنتيكاي آن تكثيار زیااد زعفاران و ایجااد بنههای عاری از عوامل بيماریزا فراهم ميكنند. پژوهشهای متعددی در زمينه كشت بافت زعفران ارائاه شاده- است. شارما و همكااران )2008 al., )Sharma et در تحقيقاي باززایي مستقيم زعفران را مورد مطالعه قارار داده و ایجااد 83/ ریزبنه از هر شاخه را در محيط ½MS حاوی 9 ميليگرم در ليتر BAو 81 گارم در ليتار سااكارز گازار كاردهاناد. كرمياان و همكاران )2004 al., )Karamian et جنينزایي ساوماتيكي را با در 4 گونه زعفران مورد بررسي قرار دادهاند. در محيط LS حاوی 4 mg/l BA + 4 mg/l NAA جناينزایاي ساوماتيكي اتفااق افتاده است. جوانهزني جنينهای بالغ روی محيط ½ MS همراه 5 mg/l GA 3 صورت گرفته است. گياهچاه كامال زمااني تشكيل شده است كه جناينهاای جواناهزده در محايط ½MS BA+ mg/l در دماااای 1 درجاااه دارای mg/l NAA سانتيگراد قرار گرفتهاناد. نتاایج تحقيقاي نشاانداده اسات كاه /1 بارای محيط MS حاوی mg/l 2,4-D +1/5 mg/l BAP القای جنينزایي سوماتيكي مناس است. تكثير كاالوس جنيناي در محاايط MS حاااوی mg/l BAP +1/15 mg/l NAA اتفاق افتاده است )2004 al,.)blazquez et در تحقيقي برروی زعفران باززایي مستقيم و غيرمستقيم مورد بررسي قارار گرفتاه است. محايط MS هماراه باا mg/l D-2,4 mg/l BAP + بهترین محيط برای باززایي مستقيم زعفران شناخته شده اسات. همچنين محيط mg/l BAP +1/ 5 mg/l 2,4-D حاوی MS باارای باااززایي غيرمسااتقيم زعفااران مناساا بااوده اساات Sharafzadeh ( شرف زاده و خوشاخوی.)Yilderim, )2007 + mg/l 2,4-D نشاندادهاند كاه )& Khoshkhooy, 2004 /8 mg/l NAA بارای تشاكيل بناه و 1/5 mg/ l BA بارای رشد ریزبنه مناس است. همچنين بنهها در محايط نايمغلظات + BA mg/l ریشهدار شدهاند. mg/l 2,4-D حاوی MS با توجه به ارز و اهميت زعفران بهخاطر اثرات دارویي غذایي و صنعتي آن و نياز آبي بسيار كمي كه دارد كشت آن در مناطق كم آب ميتواند اشتغالزایي قابل توجهي بههمراه داشاته باشاد. عليرغم قدمت كشت زعفران و ارز افازوده ایان محصاول در مقایسه با بسياری از محصوالت زراعاي رایاج در كشاور ساهم كمتری از فناوریهای نوین به آن اختصاا یافتاه و تولياد آن عمدتا بر دانش بومي متكاي باوده اسات. از آنجاایيكاه تكثيار زعفران از طریق بنههای در حال استراحت انجام مي شاود لاذا

اثر هورمونهای مختلف بر القای کالوس باززایی و تکثیر بنه زعفران... 888 بهبود خصوصيات زراعي آن توساط رو هاای اصاال نباتاات كالسيک دشوار است. هدف از این تحقيق بهبود شارایط كشات این ویترو و باززایي در محيط این ویتارو بارای بكاارگيری ایان تكنيک در سایر رو های اصاالحي مثال كشات بسااک و یاا انتقال ژن و... ميباشد كه ميتواند به ایجاد راهكارهاای جدیاد برای اصال این گياه منجر شود. همچنين تهيه پروتكل كشات بافت بهمنظور اصال زعفران و تكثير ژنوتيپهای برتار و تهياه ریزبنه یكسان كه در سالهای اولياه كشات بتواناد باه محصاول برسد نيز مدنظر است. م اد گیاهی ماده گياهي مورد استفاده در این پژوهش بنههای زعفران بودند كه از استان خراسان رضوی شهرستان قائن در فصل پایيز تهياه شدند. تعدادی از نمونهها بالفاصله بعاد از جماعآوری در شارایط درون شيشهای كشت داده شدند و نصف نمونهها بهمدت 4 مااه در یخچال در دمای 4 درجاه ساانتي راد قارارداده شاده ساپس كشت شدند. ضدعف نی برای ضدعفوني نمونهها ابتدا پوستههای اطراف بنه را جدا كرده و بهمدت 91 دقيقه زیر آب جاری قرارداده شدند تا آلودگيهاای سطحي آن از بين بارود. ساپس تيمارهاای مختلاف گنادزدایي شامل كلرید جيوه اتانول و هيپوكلریت سدیم مورد استفاده قارار گرفت )جدول (. بنهها زیر هود المينار سه مرتبه باا آب مقطار استریل شستشو داده شد به قطعات كوچک تقسايم شاده و باه اروف كشت منتقل شدند. جدول 1- تیمارهای مورد استفاده برای ضدعفونی ریزنمونههای زعفران Tale 1- Sterilization treatment for saffron explants تیمار ضدعفونی Sterilization treatment اتانول %11 بهمدت 5 دقيقه + هيپوكلریت سدیم درصد بهمدت 1 دقيقه 70% ethanol for 5 min+1% NaOCl 2 for 20 min كلرید جيوه /1 % بهمدت 1 دقيقه 0.1% mercuric chloride for 10 min اتانول %11 بهمدت 91 ثانيه + كلرید جيوه /1 % بهمدت 1 دقيقه 0.1% mercuric chloride for 20 min + 70% ethanol for 30 sec هيپوكلریت سدیم درصد بهمدت 1 دقيقه 1% NaOCl 2 for 20 min كلرید جيوه % /1 5 بهمدت 1 دقيقه 0.15% mercuric chloride for 20 min ردیف Numer 1 2 3 4 5 تکثیر و باززایی مستقیم بهمنظور باززایي مستقيم ریزنمونهها كه یک قطعاه از بناه دارای جوانه بودند به محيط كشات MS حااوی هورماونهاای گياهي انتقال یافتند. تنظيمكنندههای رشد گياهي به كار رفته در این محيط شامل BAP و D-2,4 بود )جدول (. مراحل مختلف تشكيل بنه و رشد آن بهصورت درصد مورد بررساي و یادداشات برداری قرار گرفتند. جدول 2- تیمارهای هورمونی به منظور باززایی ریزنمونههای زعفران Tale 2- Hormon treatments for regeneration of saffron explants ردیف تیمار هورمونی Numer 1 2 3 4 5 Hormon treatment MS + 1mg/l BAP MS + 2mg/l BAP MS + 3mg/l BAP MS + 1mg/l BAP + 1mg/l 2,4-D MS + 2mg/l BAP + 1mg/l 2,4-D

887 نشریه زراعت و فناوری زعفران جلد 4 شماره 2 تابستان 5931 تکثیر و باززایی غیرمستقیم بدین منظاور قطعاات بناه باه محايط كشات MS حااوی هورمونهای NAA BAP و D-2,4 منتقل شدند )جادول 9(. برای مراحل ایجاد و جوانهزني رویان از هورمونهاای NAA و BAP استفاده شد )جدول 4(. مراحل مختلف القا كالوس ایجااد رویان جوانهزني رویان و تشكيل بنه باه صاورت درصاد ماورد بررسي و یادداشت برداری قرار گرفتند. جدول 3- تیمارهای هورمونی بهمنظور کالوسزایی ریزنمونههای زعفران Tale 3- Hormon treatments for callus induction of saffron explants ردیف تیمار هورمونی Numer 1 2 3 4 5 Hormon treatment MS + 0.5mg/l BAP + 2mg/l 2,4-D MS + 1mg/l BAP + 0.25mg/l 2,4-D MS + 2mg/l BAP + 1mg/l 2,4-D MS + 2mg/l BAP MS + 3mg/l BAP جدول 4- تیمارهای هورمونی به منظور ایجاد و جوانهزنی رویان زعفران Tale 4- Hormon treatments for emryo development and germination of saffron تیمار هورمونی ردیف Numer 1 2 3 4 5 6 Hormon treatment MS + 1 / 5 mg/l NAA MS + 1 / 5 mg/l NAA MS + 1 / 5 mg/l NAA MS + 1 / 5 mg/l BAP MS + 2mg/l BAP MS + 3mg/l BAP اسيدیته همه محيطها قبل از اتوكالو روی 5/8 تنظايم شاد. كشتهاا در اتاقاک رشاد و در دماای 5 فتوپریود 6 درجاه ساانتيگاراد و ساعت روشنایي و 8 ساعت تاریكي ن هداری شادند 2011( Safarnejad,.)Khorrami & آزمایشهاا باهصاورت فاكتوریل در قال طر كامال تصادفي انجام شد كه هر كادام از تيمارها 9 تكرار داشتند. دادهها با نرمفزار SAS و Excel تجزیه و تحليل شدند. سپس با استفاده از تجزیه واریانس مقایسات كلي و با استفاده از آزمون دانكن مقایسه ميان ينها و تفاوت معنيدار بين آنها در سطح %5 تعيين گردید. نتایج و بحث ضدعف نی نتایج تجزیه تحليل دادههای مربوط به ضادعفوني نشاان ر اختالف معنيدار بين تيمارها بود. مقایسه ميان ينهاا نشاان داد كه تيمار كلرید جيوه % /1 5 بهمدت 1 دقيقاه بهتارین تيماار برای ضدعفوني زعفران ميباشد )شكل (. درصد آلاودگي ایان تيمار 1 ب ا و د ك ا ه كمت ا ر ی ن مي ا ز ا ن آل ا و د گي و بي ش ات ر ی ن در ص اد زندهماني را نشانداد. آلااودگيهااای قااارچي و باكتریااایي در زمااره شاادیدترین آلودگيهای محيط كشت هستند. ایان موجاودات باه سارعت و زودتر از مواد گياهي رشد یافته شرایط تعریف شده محيط كشت را تغيير داده و باعث رشد ضعيف یا مرگ ریزنمونههاا مايشاوند )2010.)Mehrdad, بهنظر ميرسد با توجه به این كه زعفاران در تماس مستقيم با خاک قرار دارد و خاک نيز یكي از مهمترین منابع آلودگي ریزنمونهها بهشمار ميرود. تيمار ضدعفاوني كاه از همه شدیدتر بود مناس ترین تيمار باه شامار مايرود. چارا كاه تيمارهای با شدت كمتر نيز استفاده شده بود ولي كارایي كمتری در از بين بردن آلودگيها داشت تيمارهای هيپوكلریات سادیم و الكل نيز از كارایي مناسبي برخوردار نبودند. در این رابطه عناوان شده كه محلول كلرید جياوه كاه از ساميتارین محلاولهاای سترون سازی ميباشد باید در غلظت پایين یاا زماان كوتااه بار نمونهها اثار ب اذارد تاا از انهادام و مارگ بافاتهاا توساط آن جلوگيری شود )2007 al.,.)assareh et برخالف نتایج تحقيق حاضر در تحقيقي دی ر روی زعفاران هيپوكلریات سادیم بارای ضااادعفوني معرفاااي شاااده اسااات ( & Sharafzadeh.)Khoshkhooy, 2004 این عدم انطباق احتماال به دليل تفاوت در منبع جماعآوری

pollution percentage اثر هورمونهای مختلف بر القای کالوس باززایی و تکثیر بنه زعفران... 886 ریزنمونه و اختالف در واكنش و كارایي آنها است چرا كه نتایج قابال قباول در كشات وابساته باه شارایط محيطاي و حالات فيزیولوژیكي گياه مادری است ) 2008 al.,.)krishna et 80 70 60 50 40 30 20 10 0 a c cd 1 2 3 4 5 strealization treatments a d شکل 1- مقایسه درصد آلودگی تیمارهای مختلف ضدعفونی زعفران Figure 1- Comparison of mean value for infection percentage دقيقه + هيپوكلریت سدیم درصد بهمدت 1 دقيقه) (كلرید جيوه /1 % بهمدت 1 دقيقه( 9( اتانول %11 بهمدت بهمدت 1 دقيقه) ) 4 هيپوكلریت سدیم درصد بهمدت 1 دقيقه) ) 5 كلرید جيوه % /1 5 بهمدت 1 دقيقه) )اتانول %11 بهمدت 5 91 ثانيه + كلرید جيوه % 1/ 1(70% ethanol for 5 min+1% NaOCl 2 for 20 min), 2 (0.1% mercuric chloride for 10 min), 3 (0.1% mercuric chloride for 20 min + 70% ethanol for 30 sec), 4 (1% NaOCl 2 for 20 min), 5 (0.15% mercuric chloride for 20 min) اختالف معنيداری را بين تيمارهاای ماورد اساتفاده نشاان داد. بيشترین درصاد بااززایي بناه در محايط )39/9( 2 mg/l BAP تشكيل شد )شكل و 9(. در این پژوهش هورمون BAP برای تشاكيل بناه باهطاور مساتقيم مناسا باود. مهمتارین نقاش سيتوكينينها از باين باردن غالبيات انتهاایي و باعاث تحریاک تشكيل ساقه نابجا و عق افتادگي پيری ميباشد ( & Bagheri.)Safari, 2004 در مورد گونههای درختي از قبيل عناب نياز از هورماون BAP بارای القااء شااخهزایاي اساتفاده شاده اسات )2015 )Safarnejad,. در این تحقيق استفاده از BAP باعاث تشكيل بنه شد. در تحقياق پاری و همكااران ( al., Parray et 2012( هورمون TDZ كه ناوعي سايتوكينين مايباشاد بارای بنهزایي معرفي شده است. استفاده از غلظاتهاای بااالی BAP برای توليد بنه در گذشته هم به اثبات رسيده اسات ( Sharma بدون پيشتيمار دمای پایين حدود 9 ماه طول كشيد تا اولين تشكيل بنه مشاهده شد. نمونههایي كه در یخچال قارار داشاتند حدود هفته بعد از كشت تشكيل بناه را آغااز كردناد. احتمااال دمای پایين با تغيير در تعادل هورمونها و مواد فنولي برتشاكيل بنه تأثير دارد. ولي بسته به محيط و بسته به عواملي چاون سان گياه نو ریز نمونه دما و نيز بسته به نو و غلظت هورماونهاا ميزان متفاوتي تركيبات فنلي ایجاد ميكنند. یافتههای حاصل از تحقيااق شاارفزاده و خوشااخوی) 2004 & Sharafzadeh )Khoshkhooy, روی ریزافزایي زعفران موید این مطل اسات طوریكه در تحقيق ایشان بدون پيشتيماار دماای پاایين هايو بنهای روی ریزنمونهها تشكيل نشده است. تکثیر و باززایی مستقیم نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادههاای بااززایي مساتقيم

direct regeneration percentage 887 نشریه زراعت و فناوری زعفران جلد 4 شماره 2 تابستان 5931 al., 2008.)et تيمار سرمایي مهمترین عامال در تشاكيل ریاز بنهها بر روی ریزنمونههای حاوی جوانه ماي باشاد. در تحقيقاي اثر پيش تيمار سرمایي را در باززایي گياهچه های هاپلوئيد كلازا بررسي كردهاند. نتایج نشان داده است كه اثر پيش تيمار 4 درجه ساانتي راد باه مادت 1 روز و روز باه ترتيا بيشاترین و كمترین ميزان درصد سبز شدن گياهچههای هاپلوئيد و بااززائي گيااه نرماال را باه خاود اختصاا دادناد ( al., (Ommati et 2006. در توليد گياهاان هاپلویياد نخاود باهرو كشات درون شيشهای نيز عنوان شده كه تيمار سرمادهي تاأثير داشاته اسات )2002 al.,.)vessal et بنهها برای سازگاری به جي في منتقل و سپس به گلدان و خاک انتقال یافتند. تکثیر و باززایی غیرمستقیم: همچنان كاه در شاكل 4 مشاهده ميشود مقایسه ميان ينهای درصد القای كالوس تفاوت معنيداری را بين تيمارهای ماورد اساتفاده در ساطح %5 نشاان ميدهد. بهترین محيط برای القای كالوس محايط mg/l D-2,4 + BAP mg/l شناخته شد. در نتایج بررسي كاالوسدهاي گونه مورد مطالعه به سيتو كينين و اكسين بهصورت توام واكنش نشان داد. بيشترین تعداد رویان در محيط MS با غلظت كم ( NAA /1( 5mg/ l تولياد شاد )شاكل 5(. نتاایج حاصال از بررساي جوانهزني رویانها نشانداد كه در بين محيطهای مورد اساتفاده محيط MS با /1 5 mg/l NAA بهترین تيمار برای جوانهزناي بود. از بين تيمارهای مختلف مورد اساتفاده جهات تشاكيل بناه تنها در محيط mg/l BAP + mg/l D-2,4 مشاهده شاد و در سایر محيطها بنه تشكيل نشد. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 a c c c 1 2 3 4 5 hormon treatments شکل 2- مقایسه میانگینهای تیمارهای باززایی مستقیم ریزنمونه زعفران Figure 2- Comparison of mean value for direct regeneration 1(MS + 1mg/l BAP), 2 (MS + 2mg/l BAP), 3 (MS + 3mg/l BAP), 4 (MS + 1mg/l BAP + 1mg/l 2,4-D), 5( MS + 2mg/l BAP + 1mg/l 2,4-D)

اثر هورمونهای مختلف بر القای کالوس باززایی و تکثیر بنه زعفران... 887 a c d e f شکل 3 روند تشکیل بنه بهروش باززایی مستقیم: a( جوانهزنی از ریزنمونه غده نسبتا ناقص ( رشد جوانه و تشکیل غده c( تشکیل غده )d پیاز کامل e( f( انتقال به جی فی پیاز با فلسهای Figure 3 - Corm formation through direct regeneration: a) germination of corm explant ) ud growth and corm formation c) corm formation d) onion with scales rather incomplete e) full onion f) transfer to jiffy رویانزایي رویشي فرایناد تكااملي پيچيادهای اسات كاه از بسياری جهات شبيه رویانزایاي زایشاي اسات. در مرحلاه اول بافتهای رویشي با تماایززدایي تواناایي رویاانزایاي را كسا ميكنند )مرحله القاء( و پس از دریافت محارک مناسا مراحال 1997(. در بين تنظيمكنندههای رشد اكسينها از متاداولتارین تركيبات استفاده شده بارای گاذر از مرحلاه رویشاي باه رویاان هستند )2011 al., )Rajapoor et در تحقيق حاضر بيشاترین تعداد رویان و بيشترین جوانهزني در محيط MS با غلظت كمتار et /1( توليد شد. رج تكاملي شرو ميشود. در نهایت طي بلاوغ رویاانهاای بادني 5mg/ )l NAA پور و همكاران )2011 برای جوانهزني آماده ميشوند. رویانزایي بدني ممكان اسات در پاسخ به عالمتهای متعدد از جملاه حضاور اكساين و عوامال تنشزا آغاز شود. سااطح هورمااونهااای درونزا و تركياا هورمااونهااای تنظيمكننده رشد در محيط كشت یكي از مهمترین عوامل بارای al., )Rajapoor نيا ز هورمااون اكسا يني NAA را هورمااون مناس جهت القاء رویان معرفي نمودهاناد لايكن ایشاان عناوان كردهاند با افزایش غلظات هورماون ایان روناد تصااعدی پيادا نمودهاند. شيباني و همكاران )2007 al., )Sheiani et هام باا اساتفاده از هورماونهاای D-2,4 BAP و TDZ توانساتهاناد Grie et al., دستيابي به واكنش ریختزایي مناسا اسات ( كالوسهای رویانزا توليد كنند. گزار هاای متعاددی در ماورد

emryo formation percentage callus indution regeneration 888 نشریه زراعت و فناوری زعفران جلد 4 شماره 2 تابستان 5931 نقش NAA در بلوغ رویانهای زعفران وجود دارد. در تحقيقاي ابااراهيمزاده و همكاااران 2006( al., )Erahimzadeh et گزار كردهاند كه NAA محرک رویاان زایاي در گوناههاای مختلف زعفران زراعي و وحشي است. 100 90 a 80 70 60 50 40 30 20 c 10 c c 0 1 2 3 4 5 hormon treatments شکل 4- مقایسه میانگینهای درصد القای کالوس در ریزنمونه زعفران Figure 4- Comparison of mean value for callus induction 1 (MS + 0.5mg/l BAP + 2mg/l 2,4-D), 2 (MS + 1mg/l BAP + 0.25mg/l 2,4-D), 3 ( MS + 2mg/l BAP + 1mg/l 2,4-D), 4( MS + 2mg/l BAP), 5 (MS + 3mg/l BAP) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 a a 1 2 3 4 5 6 hormon treatments شکل 5- مقایسه میانگینهای درصد تشکیل رویان در ریزنمونه زعفران Figure 5- Comparison of mean value for emryo formation 1 (MS + 1 / 5 mg/l NAA), 2 (MS + 1 / 5 mg/l NAA), 3 (MS + 1 / 5 mg/l NAA), 4 (MS + 1 / 5 mg/l BAP), 5 (MS + 2mg/l BAP), 6 (MS + 3mg/l BAP)

اثر هورمونهای مختلف بر القای کالوس باززایی و تکثیر بنه زعفران... 888 a c d e شکل 6 مراحل تشکیل بنه زعفران بهروش غیرمستقیم : a( القای کالوس از ریزنمونه ( تشکیل رویان c( جوانهزنی رویان d( تشکیل ریزبنه و e ) تشکیل و تکثیر بنه Figure 6- Cormlet formation through indirect regeneration: a) callus induction, ) emryo formation, c) emryo germination, d) cormlet formation and e) corm formation and propagation

882 نشریه زراعت و فناوری زعفران جلد 4 شماره 2 تابستان 5931 همچنين كاراگلو و همكااران )2007 al., )Karaoglu et از طریق القای رویانزایي در محايط كشات MS حااوی BAP و NAA موفق شدهاند بهطور ميان ين - ریزبنه در هر ریزنمونه توليد نمایند. در تحقيق دی ری كه روی تكثير زعفاران صاورت گرفته است تشكيل ریزبنه باا القاای رویاانزایاي باا اساتفاده از هورماونهاای 2,4-D BAP ميسرشاده اسات ( al., Raja et 2007(. یكاي از اهاداف مهام در ماورد كشات بافات زعفاران مزروعااي تشااكيل ریزبنااه اساات. از ایاان نظاار پااور و رجاا همكاران) 2011 al., )Rajapoor et هورمون IBA را هورمون مؤثر در تمایز نوشاخهها در ارتبااط باا ذخيارهساازی نشاساته و تشكيل ریزبنه عنوان نمودهاند. BAP در القای رویانزایاي نقش به غلظت این ماده در محيط كشت وابسته بود و بهنظر ميرساد كه احتماال اثر خود را از طریق ایجاد توازن با اكسينهای درونزا و تنظيم نسبت سيتوكينين باه اكساين انجاام مايدهاد. از باين تيمارهای مختلف مورد استفاده جهت تشاكيل ریزبناه تشاكيل ریزبنه تنها در محيط 2mg/l BAP + 1mg/l D-2,4 مشااهده شد و در سایر محيطها ریزبنه تشكيل نشد. ریزنمونههای زعفران برای باززایي به مقاادیر نسابتا بااالی هورمون سيتوكينين احتياج دارند و برای تشكيل بناه باه هار دو هورمون اكسين و سيتوكينين نياز دارناد كاه اكساين D-2-4 از سایر اكسينهای مورد استفاده نتایج بهتری ایجاد نماود. غلظات سيتوكينين مورد نياز برای ایجاد غده 2mg/l BAP مي باشد. منابع Adullaev, F.I. 2002. Cancer chemopreventive and tumoricidal properties of saffron. Experimental Biology and Medicine 227 (1): 20-25. Assareh, M. H., Ghoranli, M., Akari Khaaz, M., Ghamari Zare, A., and Emam, M. 2007. Micropropagation, organogenesis and using photoototropic method in Eucalyptus gongylocarpa. Pajoohesh and Sazandegi 75: 135-145. (In Persian). Bagheri, A., and Safari, M. 2004. Plant Tissue Culture. Ferdowsi University of Masshad, Press. 406 pp. (In Persian). Bathaei, S.Z., and Mousavi, S.Z. 2010. New applications and mechanism of action of saffron and its important ingredients. Critical Reviews in Food sscience and Nutrition 50 (8): 761-786. Behnia, M.R. 2008. Assessment of effect of cultivation method of corm on saffron yield in Damavand. Pajoohesh and Sazandegi in Agronomy and Horticulture 79: 101-108. (In Persian with English Summary). Blazquez, S., Piqueras, A., Serna, M.D., and Casas, J.L. 2004. Somatic emryogenesis in saffron: Optimisation through temporary immersion and polyamine metaolism. Acta Hortculturae 650: 269-276. Erahimzadeh, H., Rajaian, T., Karamian, R., Arishamchi, P., and Saora, A. 2006. Iranian Saffron, Information Pulication, Tehran. (In Persian). Fernandez, J.A. 2004. Biology, iotechnology and iomedicine of saffron. Recent Research. Development of Plant Science 2: 127-159. Ghalavand, A., and Mazaheri, D. 2000. Temperature effect on flowering and potential of Iranian saffron. Pajoohesh and Sazandegi 4: 65-69. (In Persian with English Summary). Grie, B., Schfer,F., Imani, J., Mashayekhi, K. N., Arnholdt-Schmitt, B., and Neumann, K.H. 1997. Changes in solule proteins and phytohormone concentration of cultured carrot petiole explants during induction

اثر هورمونهای مختلف بر القای کالوس باززایی و تکثیر بنه زعفران... 883 of somatic emryogenesis. Journal of Applied Botany 71: 94-103. Grilli Caiola, M. 2004. Saffron reproductive iology. Acta Horticulturae 650: 25-37. Karamian, R. 2004. Plantlet regeneration via somatic emryogenesis in four species of Crocus. Acta Horticulturae 650: 253-259. Karaoglu, C., Cocu, S., Ipek, A., Parmaksiz, I., Uraney, S., Sarihan, E., Arslan, N., Kaya, M. D., Sancak, C., Ozcan, S., Guruz, B., Mirici, S., Er, C., and Khawar, K. M. 2007. In vitro micropropagation of saffron. Proceeding of the second international symposium on saffron iology and technology. Acta Horticulture 739: 223-227. Khorrami, A., and Safarnejad, A. 2011. In vitro selection of Foeniculum vulgare for salt tolerance. Notulae Scientia Biologicae 3 (2): 90-97. Mehrdad, M. 2010. The study of Tilla egonifolie micropropagation in vitro. Thesis sumitted in partial fulfillment of the requirements. For the degree of M.Sc. in. Silviculture and Forest Ecology. 67 pp. Mollafillai, A., and Shoorideh, H. 2009. The new method of saffron production. 4 th national festival of saffron. 27-28 octoer 2009. Iran. 38 pp. (In Persian). Omidi, H., Naghdi Badi, H.A., Golzad, A, Torai, H., and Footou Kian, M.H. 2009. The effect of chemical and iofertilizer source of nitrogen on qualitative and quantitative yield of saffron. Journal of Medicinal Plants 8 (30): 98-109. (In Persian). Ommati, A., Farshadfar, E., Ardekani, M.R., and Naserian, B. 2006. Effect of cold pretreatment and filter paper in regeneration of canola haploid plants. Nin th Congress of Agriculture Sciences and Plant Breeding. Parray, J.A., Kamili, A.N., Hamid, R., and Husaini, A.M. 2012. In vitro cormlet production of saffron (Crocus sativus L.) and their flowering response under greenhouse. Genetically Modified Crop and Food 3 (4): 289-295. Raja, W., Zaffer, G., and Wanti, S.A. 2007. In vitro microcorm formation in saffron. Proceeding of the second international symposium on saffron iology and technology. Acta Horticulture 739: 291-301. Rajapoor, S., Saoora, A., and Vatanpour Azghandi, A. 2011. Changes in exogenous hormone concentration and its effect on somatic emryo maturation and microcorm of saffron. Journal of Plant Biology 8: 41-58. Safarnejad, A. 2015. Effect of growth regulators on in vitro regeneration of Ziziphus jujue. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research 23 (1): 40-48. (In Persian with English Summary). Salopek-Sondi, B. 2004. Silver nanoparticles as antimicroial agents: a case study on E.coli as a model for gramnegative acteria. Journal of Colloid and Interface Science 275: 177-182. Sepaskhah, A.R., and Kamgarj-Haghighi, A. 2009. Saffron irrigation regime. International Journal of Plant Production. 3: 1-16. Sharafzadeh, S.H., and Khoshkhooy, M. 2004. Effects of precooling and growth regulators on micropropagation of estahan saffron. Iranian Journal of Horticulture Science 5 (3): 129-136. (In Persian). Sharma, K.D., Rathour, R., Sharma, R., Goel, S., Sharma, T.R., and Singh, B.M. 2008. In vitro cormlet

888 نشریه زراعت و فناوری زعفران جلد 4 شماره 2 تابستان 5931 development in Crocus sativus. Biologia Plantarum 52 (4): 709-712. Sheiani, M., Azghandi, A.V., and Nemati, S.H. 2007. Induction of somatic emryogenesis in saffron using thidiazuron. Pakistan Journal of Biological Science 10: 3564-3570. Vessal, S.R., Bagheri, A., and Safarnejad, A. 2002. The possiility of in vitro haploid production in chickpea (Cicer arietinum L.). Journal of Science and Technology of Agriculture and Natural Resources 6 (2): 68-76. Winterhalter, P., and Strauinger, M. 2000. Saffron-renewed interest in an ancient spice. Food Reviews International 16:39-59. Yilderim, E. 2007. Development of in vitro micropropagation techniques for saffron (Crocus sativus L.). Biology Master's Thesis. Middle East Technical University. 76 P.

Astracts, Vol. 4, No. 2, Summer 2016 6 The Effect of Different Hormones on Callus Induction, Regeneration and Multiplication of Saffron (Crocus Sativus L.) Corms Aas Safarnejad 1*, Seyedeh Bii Leyla Alamdari 2, Hadi Darroudi 3 and Marzieh Dalir 2 Received: 4 May, 2015 Accepted: 26 Octoer, 2015 DOI: 10.22048/jsat.2016.17364 Astract Saffron (Crocus sativus; Iridaceae) is an important economic and medicinal crop in Iran. The saffron that is an heraceous triploid geophyte is used mainly as a source of secondary metaolites having aromatic and medicinal value. The plant develops annually from uds on the mother corm i.e. a thickened stem - which acts as a resting, perennating storage organ. In this research in vitro propagation of Crocus sativus through direct and indirect methods has een studied. Corm slices as explants were sterilized and transferred to MS media with different concentrations of plant growth regulators. The results showed that use of HgCl 2 0.15% for 20 minutes is the est treatment for sterilization. The results of ANOVA of direct regeneration indicated that the most corm formation was oserved in 2 mg/l BAP. Maximum callus induction was achieved on MS supplemented with 1 mg/l 2,4-D + 2 mg/l BAP. As results indicate the most numer of emryos were otained in MS medium containing 0.15 mg/ l NAA. Also this medium was suitale for germination of emryo. Corm formation was only oserved in MS supplemented with1 mg/l 2, 4-D + 2 mg/l BAP in the indirect method. The corm was transferred to JF pot for adaptation and then it was transferred to the pot and soil for growing. Keywords: growth regulators, emryo, in vitro 1- Associate Professor, Faculty memer of Khorasan Razavi Agricultural and Natural Resources Research Center or Mashhad Branch, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Mashhad, Iran. 2- MSc, Biotechnology, Post Address: Tissue Culture Research Department, Mashhad Branch, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Mashhad, Iran. 3- MSc, Forestry, Post Address: Tissue Culture Research Department, Mashhad Branch, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Mashhad, Iran.